粗蛋白的测定

参考标准：JJG 196-2006 常用玻璃量器检定规程

GB-T 6432-1994 饲料中粗蛋白测定方法

实验原理：凯氏定氮法是使样品经硫酸和催化剂一同加热消化，使有机氮分解转化为氨与硫酸化合为硫酸氢铵。然后加碱蒸馏，使铵游离出来，用硼酸吸收，再用标准盐酸滴定，计算氮的含量，乘以6.25可折算成粗蛋白含量。

主要仪器及试剂：

1.凯氏定氮瓶及蒸馏装置  

2.五水硫酸铜  

3.硫酸钾     

4.98%浓硫酸

5.2%硼酸溶液:2g硼酸溶于100ml水溶液

6.40%氢氧化钠溶液:40g氢氧化钠溶于100ml水溶液

7.0.1%甲基红：0.1g甲基红溶于100ml乙醇溶液，搅拌溶解                     

8.0.5%溴甲酚绿：0.5g溴甲酚绿溶于100ml乙醇溶液，搅拌溶解

9.甲基红-溴甲酚绿混合指示剂：0.1%甲基红与0.5%溴甲酚绿等体积混合，保存期三个月。

10.0.02mol/L的盐酸标准溶液(保存期2个月)

实验操作步骤：

1.称样：

按粗蛋白含量称取样品质量（可控制点：降低容量误差对结果绝对误差的影响），

准确至0.0002g，置于干燥的消化管中（可控制点：避免样品粘挂于消化管壁影响样品的消化）。

2.消化：加入硫酸铜约0.4g，加入硫酸钾约6g，轻轻抖动摇匀，再加入15ml浓硫酸，摇匀，开始应小火加热使样品焦化、泡沫消失(可控制点：避免样品在消化过程中上冲粘附于消化管壁)，在消化炉上消化一定的时间至消化液呈澄清透明的蓝绿色，相应的消化时间对应于上表中，最终的消化仲裁判定应在溶液澄清后继续消化至少30min（可控制点：消化完全）。

3.转移：将试样消煮液冷却，用洗瓶加入少量蒸馏水稀释（不可直接转移高浓度的消煮液，因为稀释是个剧烈的放热过程，容易炸裂容量瓶），摇匀，转入100ml容量瓶中，转移过程应充分，A.确保转移过程中消化管口始终在漏斗之上并向下倾斜，用带细尖嘴洗瓶冲洗管口3遍，在漏斗上靠掉管口边缘溶液再向上竖起，B.冲洗内壁，上下甩动3次，同A转移入容量瓶中，再重复2次。

4.定容:冷却后用水稀释至刻度，摇匀，作为试样分解液。严禁热定容，即溶液未冷却进行定容。要加速冷却过程，可将容量瓶盖好盖子放入流水中进行冷却。

5.蒸馏：

A.蒸汽发生器的水中应加入甲基红指示剂数滴，硫酸数滴，在蒸馏过程中保持此液为橙红色，否则需补加硫酸（可控制点：确保水中氨以硫酸铵形式存在，保证蒸馏过程中空白的稳定性）。

B.将半微量蒸馏装置的冷凝管末端浸入装有20ml硼酸吸收液和2滴溴甲酚绿—甲基红指示剂的锥形瓶内。

C.用待蒸馏试样分解液润洗移液管2cm长末端，再放入容量瓶中吸取试液润洗移液管2-3次；准确移取试样分解液10.00ml注入蒸馏装置的反应室中，放入时移液管应靠在反应室入口的底部上，放完后不可用蒸馏水冲洗移液管外壁；用少量蒸馏水冲洗进样入口，塞好入口玻璃塞，再加10ml左右氢氧化钠溶液，小心提起玻璃塞使之流入反应室，直至反应液变棕色，将玻璃塞塞好，且有碱剩余在入口处密封，防止漏气。蒸馏4min降下锥形瓶使冷凝管末端离开吸收液面，用蒸馏水冲洗冷凝感末端，洗液均流入锥形瓶内，再蒸馏1min（可控制点：以pH试纸指示蒸馏终点），然后停止蒸馏。

6.滴定：用0.02mol/L标准盐酸溶液滴定，溶液由绿色或蓝绿色变为淡红色为终点。同样条件做空白，取10.00ml水从步骤2开始或者从步骤5开始。

7.计算：

粗蛋白（%）= EQ EQ EQ \A() \F(（V₁-V₀）×C×0.0140×6.25,m×10.00/100.0) ×100%

注意事项：

1.消化时若不易呈透明溶液，可将试液放冷后慢慢加入30％过氧化氢2—3mL，以促进氧化。如试样是含脂类特别多的样品，有时需要增加浓硫酸的用量，如分解冷却后，消化液呈完全固体状态，则是浓硫酸量不足，氮的回收率会降低。

2.消化过程中保持缓慢沸腾，避免试样溅于瓶壁，难于消化使氨损失。

3.实验中要保证硫酸足量，因为过多的硫酸钾形成硫酸氢钾，会削弱了硫酸的消化作用，硫酸钾的作用是增加溶液的沸点，硫酸钾添加量过少加速消化作用将减弱，加入过多溶液会析出结晶，共结晶现象将使部分硫酸氢铵损失。

4.消化时间视不同样品含脂肪，蛋白质的量而定，消化液按黑色→黄绿色→绿色→蓝色或浅绿色变化，一般样品消化液呈现绿色后，再消化30min即可（样品消化液通常开始为黑色，不久变成蓝色澄清状态，这种过程是炭化的有机物完全被氧化的变化，而它决不表示样品中的氮素全部转化为NH⁴⁺的变化，一般情况样液澄清后继续消化60min，其氮素的回收率最理想。

5.通入蒸汽蒸馏时，吸收瓶中的硼酸接收液温度不宜超过40℃，如果超过45℃硼酸对NH₃的吸收减弱，造成氮的损失。可以采取的措施包括降低蒸汽通入量(比如分流蒸汽或者降低加热温度)、增加冷却水流量、使用其他可能的措施降低吸收液温度。

6.NH⁴⁺是以NH₃的形式完全蒸馏出来的，可用pH试纸或红色石蕊试纸检验馏出液是否呈碱性以判定蒸馏终点。

7.标准酸浓度的准确浓度（程度）对测定结果影响很大，因此，标准酸的浓度必须准确认真标定。

8. 硫酸铵回收率测定

精确称取0.25g～0.30g硫酸铵，代替试样按标准中试样消解方法进行消解，测得的硫酸铵中氮的含量应是21.19±0.2%,否则应检查仪器的气密性、标准溶液是否正确。

氮含量（%）= EQ EQ

式中：

V₁   ——滴定试样所需标准溶液的体积， V₀  ——滴定空白所需标准溶液的体积，

C  ——标准溶液的浓度，             M  ——试样的质量，

100——试样分解液定容体积，         10 ——用于蒸馏的分解液的体积。

硫酸铵有吸湿性，固结成块，在105℃烘干1个小时能保证硫酸铵的干燥同时把硫酸铵分解质量损失降低在可接受的误差范围内<0.2%。